การกรองการไหลแบบ Tangential ของ TFF รวมกับการหมุนเหวี่ยงแบบพิเศษเพื่อการเตรียมถุงนอกเซลล์ขนาดเล็กที่มีประสิทธิภาพ
Aug 28, 2026| ถุงนอกเซลล์ขนาดเล็ก (sEVs) เป็นถุงขนาดนาโนที่ถูกหลั่งโดยเซลล์ที่มีกรดนิวคลีอิก โปรตีน โมเลกุลขนาดเล็ก และส่วนประกอบอื่นๆ และมีบทบาทสำคัญในการสื่อสารระหว่างเซลล์ ถุงนอกเซลล์ขนาดเล็กประเภท Exosome- มีความคล้ายคลึงกันสูงกับเซลล์ต้นกำเนิด เมื่อเปรียบเทียบกับอนุภาคนาโนเทียม พวกมันมีอัตราการกวาดล้างภูมิคุ้มกันที่ต่ำกว่าและความเป็นพิษต่อเซลล์ที่ต่ำกว่า ทำให้พวกมันมีแนวโน้มว่าจะเป็นผู้สมัครใหม่ยานพาหนะส่งยาในวิฟ. เซลล์เกือบทุกประเภทสามารถหลั่งถุงน้ำเหล่านี้ได้ และการวิจัยเกี่ยวกับการนำไปใช้เป็นพาหะของยากำลังค่อยๆ ย้ายจากห้องปฏิบัติการไปสู่การใช้งานทางคลินิก อย่างไรก็ตาม,การผลิตขนาดใหญ่-ยังคงเป็นปัญหาคอขวดที่สำคัญ.
วิธีการปัจจุบันสำหรับการแยกถุงนอกเซลล์
วิธีการแยกถุงนอกเซลล์ในปัจจุบันประกอบด้วยการหมุนเหวี่ยงแบบพิเศษ, การหมุนเหวี่ยงด้วยเกรเดียนต์ของความหนาแน่น, โครมาโทกราฟีแบบแยกขนาด (SEC) และการตกตะกอนของโพลีเอทิลีนไกลคอล (PEG).
การตกตะกอน PEG ให้ผลผลิตสูงและการดำเนินการที่เรียบง่าย แต่มีความเกี่ยวข้องกับการปนเปื้อนอย่างมีนัยสำคัญจากโปรตีนที่ไม่ต้องการ การปั่นแยกด้วยเกรเดียนต์ของความหนาแน่นและ-โครมาโตกราฟีแบบแยกขนาดสามารถให้ผลิตภัณฑ์ที่มีความบริสุทธิ์สูง- แต่ประสิทธิภาพค่อนข้างต่ำและกระบวนการนั้นใช้เวลา- Ultracentrifugation มีการใช้กันอย่างแพร่หลาย แต่ปริมาณการประมวลผลถูกจำกัดด้วยความสามารถในการหมุนเหวี่ยง ทำให้ยากต่อการขยายขนาด
การประยุกต์ใช้การกรองการไหลแบบสัมผัสเพื่อการแยก sEV
การกรองการไหลแบบสัมผัส (TFF) ได้ถูกนำมาใช้กับการแยกอนุภาคนาโน เช่น ไลโปโซมและเวกเตอร์เลนติไวรัสแล้ว ใน TFF สารป้อนจะไหลเป็นเส้นสัมผัสผ่านพื้นผิวเมมเบรน ซึ่งช่วยลดการเปรอะเปื้อนของเมมเบรน และทำให้กระบวนการขยายขนาดได้ง่ายขึ้น
เนื่องจากถุงนอกเซลล์ขนาดเล็กโดยทั่วไปมีตั้งแต่30–200 นาโนเมตรเส้นผ่านศูนย์กลางตลับเมมเบรน 0.45 μmสามารถเลือกได้ในระบบ TFF เพื่อกำจัดโปรตีนและถุงน้ำขนาดใหญ่ออกไปในขณะที่ตลับเมมเบรน 300 kDaสามารถใช้เพื่อกำจัดโปรตีนน้ำหนักโมเลกุลขนาดเล็ก-และทำให้ถุงนอกเซลล์ขนาดเล็กที่อยู่ในอาหารเลี้ยงเชื้อเข้มข้น
การศึกษาคุณลักษณะของวัตถุดิบหลังการแยก TFF
การวิเคราะห์การติดตามอนุภาคนาโน (NTA) แสดงให้เห็นว่าเส้นผ่านศูนย์กลางของอนุภาคส่วนใหญ่มีการกระจายภายในช่วง0–250 นาโนเมตร.
อย่างไรก็ตาม กล้องจุลทรรศน์อิเล็กตรอนแบบส่องผ่าน (TEM) เผยให้เห็นโปรตีนที่ปนเปื้อนจำนวนมาก ในขณะที่ไม่พบถุงนอกเซลล์ ผลลัพธ์เหล่านี้บ่งชี้ว่าจำเป็นต้องมีขั้นตอนการทำให้บริสุทธิ์ขั้นปลายเพิ่มเติมเพื่อทำให้ถุงนอกเซลล์บริสุทธิ์เพิ่มเติม
การแสดงคุณลักษณะของ TFF Concentrate หลังจากการกรองแบบอัลตราฟิลเตรชัน 100 kDa
สารเข้มข้น TFF ถูกแปรสภาพเพิ่มเติมโดยใช้หลอดอัลตราฟิลเตรชัน 100 kDa.
NTA แสดงให้เห็นว่าเส้นผ่านศูนย์กลางของอนุภาคในตัวเข้มข้นที่ได้รับหลังจากการกรองแบบอัลตราฟิลเตรชันหนึ่งและสองรอบส่วนใหญ่ยังคงอยู่ในช่วงของ0–250 นาโนเมตร. อย่างไรก็ตาม การทำอัลตราฟิลเตรชั่นสองครั้งส่งผลให้จำนวนอนุภาคที่ได้รับลดลงอย่างมีนัยสำคัญ
การวิเคราะห์ TEM แสดงให้เห็นว่าไม่มีการสังเกตโครงสร้าง-คล้ายตุ่มในความเข้มข้นของการกรองด้วยอัลตราฟิลเตรชั่น-ครั้งหรือสองครั้ง- ครั้ง ขณะที่โปรตีนที่ปนเปื้อนยังคงอยู่เป็นจำนวนมาก
ดังนั้น,การกรองแบบอัลตราฟิลเตรชัน 100 kDa ไม่สามารถนำมาใช้อย่างมีประสิทธิภาพเพื่อทำให้อาหารเลี้ยงเชื้อบริสุทธิ์หลังจากความเข้มข้นของ TFF.
การแสดงคุณลักษณะของสารเข้มข้น TFF ที่ทำให้บริสุทธิ์โดยการหมุนเหวี่ยงด้วยความเข้มข้นสูงเป็นพิเศษ
NTA แสดงให้เห็นว่าเส้นผ่านศูนย์กลางอนุภาคของผลิตภัณฑ์บริสุทธิ์มีการกระจายส่วนใหญ่ภายในช่วง0–250 นาโนเมตร.
ที่สำคัญ TEM เปิดเผยโครงสร้างคล้ายตุ่ม-อย่างชัดเจนในมุมมองที่แตกต่างกัน ผลลัพธ์เหล่านี้แสดงให้เห็นว่าหลังจากทำให้อาหารเลี้ยงเชื้อเข้มข้นโดยใช้ TFF แล้วultracentrifugation สามารถนำมาใช้ในภายหลังเพื่อแยกและทำให้บริสุทธิ์ของถุงนอกเซลล์เพิ่มเติม.
การศึกษาคุณลักษณะของ sEV ที่แยกได้จากสื่อที่มีการปรับสภาพเซลล์ต้นกำเนิดมีเซนไคมัลโดยใช้ TFF รวมกับการหมุนเหวี่ยงด้วยความเข้มข้นสูงเป็นพิเศษ
NTA แสดงให้เห็นว่าเส้นผ่านศูนย์กลางอนุภาคของผลิตภัณฑ์บริสุทธิ์มีการกระจายส่วนใหญ่ภายในช่วง0–250 นาโนเมตร.
TEM สังเกตโครงสร้างคล้ายตุ่ม{0}} การวิเคราะห์เวสเทิร์นบล็อตแสดงให้เห็นการแสดงออกเชิงบวกของโปรตีนที่เกี่ยวข้องกับถุงนอกเซลล์-CD9, CD63 และ ALIXในถุงนอกเซลล์บริสุทธิ์
ผลลัพธ์เหล่านี้ยืนยันว่าถุงนอกเซลล์ขนาดเล็กที่บริสุทธิ์มีเอ็กโซโซม ซึ่งบ่งชี้ว่าวิธีนี้ยังสามารถใช้สำหรับการแยกและการสกัดที่แปลกใหม่.
สรุป: TFF รวมกับการหมุนเหวี่ยงด้วยความเข้มข้นสูงเป็นพิเศษเพื่อการเตรียม sEV คุณภาพสูง-
การศึกษาแสดงให้เห็นว่าความเข้มข้นของ TFF เพียงอย่างเดียวส่งผลให้ผลิตภัณฑ์มีโปรตีนปนเปื้อนอยู่เป็นจำนวนมาก ดังนั้นจึงไม่เพียงพอสำหรับการได้รับถุงนอกเซลล์ที่มีคุณสมบัติเหมาะสม
ในทำนองเดียวกันการใช้ aหลอดอัลตราฟิลเตรชัน 100 kDa สำหรับการทำให้บริสุทธิ์ขั้นที่สองไม่ได้ให้โครงสร้างตุ่มที่สมบูรณ์ครบถ้วนอย่างมีประสิทธิภาพ
ด้วยการรวมความเข้มข้นของ TFF เข้ากับการทำให้บริสุทธิ์ด้วยการหมุนเหวี่ยงสูงเป็นพิเศษ ทำให้สามารถรวมข้อดีของทั้งสองเทคนิคเข้าด้วยกันเพื่อให้ได้มาผลิตภัณฑ์ถุงเล็กๆ ภายนอกเซลล์คุณภาพสูง-.
เมื่อเปรียบเทียบกับการหมุนเหวี่ยงแบบพิเศษแบบธรรมดาเพียงอย่างเดียว กระบวนการแบบรวมสามารถทำได้อย่างมีประสิทธิผลลดเวลาการประมวลผลโดยรวมและปรับปรุงประสิทธิภาพการแยก.
ในขั้นตอนการทำงานนี้TFF ช่วยให้เพิ่มปริมาณตัวอย่างจำนวนมาก-ได้อย่างรวดเร็วซึ่งจัดการกับข้อจำกัดของการหมุนเหวี่ยงแบบพิเศษแบบธรรมดาในการประมวลผลตัวอย่างปริมาณมาก จากนั้นการปั่นแยกด้วยความเข้มข้นสูงจะทำการทำให้บริสุทธิ์อย่างล้ำลึกเพื่อกำจัด-สิ่งเจือปนของโปรตีนที่มีความเข้มข้นร่วมออกไป ขณะเดียวกันก็ช่วยรักษาความบริสุทธิ์และความสมบูรณ์ของถุงน้ำ
นอกจากนี้กระบวนการนี้ไม่จำเป็นต้องมีการเพิ่มเติมรีเอเจนต์การตกตะกอนทางเคมีจากภายนอกช่วยรักษากิจกรรมทางชีวภาพของถุงน้ำให้มากที่สุดเท่าที่จะเป็นไปได้
จากมุมมองของการแปลเชิงอุตสาหกรรม กระบวนการนี้มีความสำคัญขยาย-ศักยภาพให้มากขึ้นและอาจช่วยจัดการกับความท้าทายที่เกี่ยวข้องกับการผลิตถุงนอกเซลล์ขนาดใหญ่-การส่งมอบยา เวชศาสตร์ฟื้นฟู และการพัฒนาผลิตภัณฑ์ที่เกี่ยวข้อง. นอกจากนี้ยังเป็นพื้นฐานการทดลองที่มั่นคงสำหรับการเพิ่มประสิทธิภาพกระบวนการในภายหลังและการผลิตในระดับนำร่อง-
อ้างอิง
หวังหลิง, หลี่เหมิงซือ, ซูซา และคณะการสร้างวิธีการแยกถุงนอกเซลล์ขนาดเล็กโดยการกรองการไหลแบบสัมผัสร่วมกับการหมุนเหวี่ยงด้วยความเข้มข้นสูง วารสารชีววิทยาจีน, 2022, 35(9): 1096–1101. ดอย: 10.13200/j.cnki.cjb.003713